Nguyễn Văn Mầu sinh ngày 21[2] hoặc 22[3] tháng 1 năm 1914 tại Bà Rịa. Cậu bé Mầu là con út trong gia đình gồm có 4 người con.[4]

Năm 11 tuổi, Nguyễn Văn Mầu được linh mục Gioan Baotixita Nguyễn Bá Tòng, chánh xứ Bà Rịa, dẫn dắt và hướng dẫn theo con đường tu trì. Năm 1926, cậu chính thức bắt đầu con đường tu trì bằng việc nhập học Tiểu chủng viện Thánh Giuse Sài Gòn.[4]

Sau quá trình dài hạn tu học, ngày 21 tháng 9 năm 1940, Nguyễn Văn Mầu được thụ phong linh mục. Sau khi được ử hành nghi thức truyền chức, linh mục Mầu được bổ nhiệm lần lượt đảm trách công việc mục vụ giáo xứ khắp Địa phận Sài Gòn[5]: sau khi thụ phong, quản nhiệm giáo xứ Lương hoà thượng. Ba năm sau đó, đảm trách quản nhiệm giáo xứ Bến Gỗ trong thời gian ngắn trước khi quản nhiệm các xứ đạo Cái Thia, Cái Sao, Cái Bèo, Mỹ Lợi từ năm 1943 đến 1947.[4]

Năm 1948, linh mục Nguyễn Văn Mầu được bổ nhiệm làm linh mục Tuyên uý Côn Đảo, Bảo Lộc trong thời gian ngắn cho đến năm 1949, khi ông được điều chuyển đến quản nhiệm giáo xứ Bảo Lộc. Năm 1950, ông tiếp tục được thuyên chuyển làm linh mục quản nhiệm Đơn Dương, Cầu Đất, Lạc Lâm, Bắc Hội, sau đó đảm trách xứ đạo Vũng Tàu từ năm 1953 đến 1955.[4]

Trong khoảng thời gian từ năm 1955 đến năm 1960, Nguyễn Văn Mầu đảm trách vai trò quản lý nhà thờ Chợ Quán và Bề trên nhà phước Chợ Quán.[2] Trong khoảng thời gian từ năm 1961 đến năm 1964, ông đảm trách vai trò linh mục giáo xư Hưng Phú.[6] Từ năm 1966 đến 1968, ông làm Giám đốc Đại chủng viện Thánh Giuse Sài Gòn.[2]